Analytische & Translationale Genomik
Die gemeinsame Ressource „Analytische und Translationale Genomik“ (ATG) ist für die Weiterentwicklung der grundlegenden, klinischen und bevölkerungsbezogenen Krebsforschung von entscheidender Bedeutung. Sie bietet UNMCCC-Mitgliedern und Nichtmitgliedern kostengünstige und umfassende Genomanalysedienste, darunter Next-Generation-Sequencing (NGS), Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq), räumliche Genomik, initiale Datenanalyse und Unterstützung für funktionelle Genomik-Assays.
und andere genomikbezogene Technologien.
Die Shared Resource wird vom UNM Comprehensive Cancer Center durch den CCSG-Kernzuschuss P30CA118100 und zusätzliche Mittel sowie Mittel des Staates NM und Benutzergebühren finanziert.
Das kompetente Personal steht den Anwendern beratend zur Seite, um sie bei der Erstellung der bestmöglichen Experimente und der Optimierung der Qualität der generierten Daten zu unterstützen.
Fakultätsleiter
Viswanathan Palanisamy, PhD
Lehrer, Innere Medizin/Molekulare Medizin
Tel: (505) 272-0652
Technischer Direktor / Bioinformatik
Kathryn (Charlie) Brayer, PhD | CRF G22A
Leitender technischer Mitarbeiter
Kel Cook, PhD | CRF 118, Tel: (505) 272-5564
Magdalena (Maggie) Cyphery | CRF 119, Tel: (505) 272-5564
Analytische und Translationale Genomik
Das ATG ist für alle Forscher der University of New Mexico (UNM) und ihrer Partnerinstitutionen zugänglich. Sie müssen jedoch unbedingt die Quelle P30CA118100 angeben und das ATG sowie andere vom UNMCCC gemeinsam genutzte Ressourcen erwähnen, die zur Datenerstellung verwendet wurden.
Um unsere Beiträge zu würdigen, bitten wir Sie, den folgenden Text in den Danksagungsabschnitt Ihrer Manuskripte aufzunehmen:
Diese Studie erhielt teilweise Finanzierung durch den UNM Comprehensive Cancer Center Support Grant NCI P30CA118100 und nutzte die Analytical and Translational Genomics Shared Resource.
Wichtige Dienstleistungen, Technologien und Ausrüstung
Hochdurchsatz-DNA-Seq und RNA-Seq. ATG bietet Gesamtgenomsequenzierung, Bulk-RNA-Sequenzierung, ChIP-Sequenzierung, RIP-Sequenzierung, Exom- und kleine RNA-Analyse mit dem Singular Genomics G4-Sequenzierer an. Als Ausgangsmaterial kommen Zellen, Speichel, Blut und FFPE- oder frisch gefrorene pathologische Proben infrage.
10x Genomische Einzelzellsequenzierung. Mithilfe des 10x Genomics Chromium-Controllers zusammen mit einem Countess II Automated Cell Counter und einem Miltenyi gentleMACS Octo Dissociator zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen bereiten die Mitarbeiter von ATG die Proben vor und erstellen die NGS-Bibliotheken für NGS von DNA und RNA.
10x Visium-HD und Xenium in situ für die Analyse des gesamten Transkriptoms und der gezielten Genexpression. In Zusammenarbeit mit der Human Tissue Repository & Tissue Analysis (HTR-TA) Shared Resource bietet das ATG räumliche Gesamttranskriptomanalysen von frisch gefrorenem und FFPE-Gewebe mithilfe der räumlichen Genexpressionsverfahren Visium-HD und Xenium in situ von 10x Genomics an. Die räumliche Genexpression von Visium HD beschreibt das vollständige Transkriptom ganzer Gewebeschnitte und bietet morphologischen Kontext und eine hohe zelluläre Auflösung. Xenium in situ ermöglicht die subzelluläre Hochdurchsatzkartierung von bis zu 5,000 Genen neben Multiplexproteinen innerhalb desselben Gewebesegments, die in Zusammenarbeit mit dem HTR-TA zur Probenvorbereitung gewonnen wurden.
NGS-Datenanalyse, scRNA-seq und Interaktionen mit den gemeinsam genutzten Ressourcen für Biostatistik und Bioinformatik & Datenwissenschaft (BDS). Die ATG koordiniert mit den gemeinsamen Ressourcen der Biostatistik und des BDS die Erstellung von Qualitätskontrollanalysen und die Entwicklung von Datenanalyse-Pipelines für die G4-Singular-Daten, einschließlich der Erkennung von Einzelnukleotidvarianten (SNV) aus DNA-Proben, Genexpressionsanalyse, Variantenanalyse aus RNA, scRNA-Sequenzdaten, Erkennung von Fusionstranskripten aus RNA-Sequenzdaten und Kopienzahlvarianten (CNV). Die verarbeiteten Dateien werden in unserem sicheren AWS-Cloud-Konto gespeichert und von ATG-Mitarbeitern oder dem BDS mithilfe angepasster R-Skripte für nachgelagerte Analysen verwendet. ATG-Technikdirektor Brayer fungiert als leitender Bioinformatiker und Verbindungsmann zu den gemeinsamen Ressourcen der Biostatistik und des BDS, um Studiendesign und Datenanalyse zu unterstützen.
Datenspeicherung und Datenverarbeitung. Die ATG unterhält ein sicheres, HIPAA-konformes und IRB-geprüftes AWS-Konto, auf dem große Datensätze gespeichert und analysiert werden können. Alle Daten werden anonymisiert, während der Übertragung verschlüsselt und gespeichert. Nur autorisierte Benutzer haben Zugriff, wofür eine Zwei-Faktor-Authentifizierung erforderlich ist. Zur Sicherheit genomischer Daten hält sich die ATG an die Richtlinien der NIH Security Best Practices für Daten mit kontrolliertem Zugriff, vorbehaltlich der NIH-Richtlinie zur Weitergabe genomischer Daten.
Sonstige Dienstleistungen. Das ATG verfügt über einen Agilent BioAnalyzer, ein Qubit-Fluorometer, einen Miltenyi gentleMACs Octo Dissociator mit Heizgeräten (zur Erzeugung von Einzelzellsuspensionen aus Gewebe), einen Countess II Zellzähler und ThermoFisher QuantStudio 6 Pro Q-PCR, die den UNMCCC-Mitgliedern zur Verfügung stehen. Für die automatisierte Extraktion von Nukleinsäuren in großen Mengen steht ein Qiagen EZ2 DNA/RNA-Extraktionsroboter zur Verfügung.
ATG kann folgende Typen sequenzieren:
- Nachweis von Mutationen oder Genvarianten. Dabei kann es sich um die Beurteilung des Ausmaßes genetischer Mutationen in einem Tumor, die Analyse spezifischer genetischer Variationen bei einer bestimmten Krebsart oder Krankheit oder die Bewertung der Reaktion von Zellen auf DNA-Schäden nach einer Verletzung oder Behandlung handeln. Normalerweise wird dies durch gezielte Genpanel-Sequenzierung erreicht, um Gene zu analysieren, die mit Krebs oder bestimmten Krankheiten in Verbindung stehen.
- Genexpressionsstudien. Transkriptionelles Profiling von Zellen, Geweben, Organoiden oder Patientenproben, entweder als einzelne Zellen oder in größeren Mengen.
- Eine Reihe von Chromatin-Zustandsanalyse-Tests, von DNA-Methylierungsstudien über ATAC-Tests bis hin zu ChIP-seq, sind verfügbar.
- Untersuchung nicht-kodierender RNAs wie ncRNAs, lincRNAs, miRNAs und tRNAs.
Bitte wenden Sie sich entweder an Kel Cook (kelcook@salud.unm.edu) oder Kathryn Brayer (kbrayer@salud.unm.edu), um einen Beratungstermin zu vereinbaren.
ATG verwendet iLab zur Abrechnung.
Bei Fragen bzgl iLabs oder für die Einrichtung eines Kontos/PR zur Nutzung in der gemeinsam genutzten Ressource senden Sie bitte eine E-Mail an Palakshi Reddy Bandapalli oder rufen Sie 505-272-4539.
Genomik-Instrumente
Der Singular Genomics G4 Sequenzer
- Flexibler und schneller Paired-End-Sequenzer
- Kann in 1.6 Stunden bis zu 2 Milliarden 150 x 24 bp-Reads erzeugen
- Kann für verschiedene Leselängen konfiguriert werden
- Kompatibel mit fast allen Bibliotheken, die auf Illumina-Instrumenten sequenziert werden können.
Für weitere Informationen: https://www.singulargenomics.com/
Das 10x Genomics Chromium iX
- Teilt Zellen oder Kerne für die Einzelzellsequenzierung auf
- Erfasst RNA, Protein und/oder Chromatin
- Untersuchung der Genexpression, des Repertoires von Immunzellen, der Zugänglichkeit von Chromatin und von CRISPR-Störungen
- Die Eingaben variieren je nach Test, umfassen jedoch lebende Zellsuspensionen, Kerne, fixierte Zellen, gefrorenes Gewebe und FFPE-Blöcke. Speziesunabhängige Tests verfügbar
Für weitere Informationen: https://www.10xgenomics.com/instruments/chromium-x-series
Der 10x Genomics Xenium Analyzer
- Räumliche Transkriptomik-Bildgebungsplattform
- Subzelluläre Auflösung
- Kann bis zu 5,000 Gene erfassen
- Mehrere vorgefertigte Gen-Panels, die weiter angepasst werden können (https://www.10xgenomics.com/products/xenium-panels)
Für weitere Informationen: https://www.10xgenomics.com/platforms/xenium
Der 10x Genomics CytAssist
- Erleichtert räumliche Transkriptomik-Assays mit Visium und Visium HD
- Beginnen Sie mit FFPE-Blöcken oder vorgeschnittenen FFPE- und Tiefkühlabschnitten
- Kompatibel mit H&E- oder Immunfluoreszenz-gefärbten Schnitten
Für weitere Informationen: https://www.10xgenomics.com/instruments/visium-cytassist
- Agilent Bioanalyzer: Analysieren Sie die Qualität/Quantität von DNA und RNA mit minimalem Aufwand. (https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument)
- Qubit II-Fluorometer: DNA- und RNA-Quantifizierung.
- ThermoFisher/Invitrogen Countess II: Zellen zählen und Anteil lebender Zellen in einer Probe quantifizieren.
- Miltenyi Biotec sanfter MACS Octo Dissociator mit Heizgeräten: Dissoziieren Sie Gewebeproben vor der Einzelzellsequenzierung.
- Qiagen EZ2: Automatisierte DNA- und RNA-Extraktion.
- ThermoFisher QuantStudio 6 Pro Q-PCR. Echtzeit-PCR-System mit 96- und 384-Well-Blöcken für Flexibilität und einfache Genexpressionsanalysen.
Ausgewählte Instrumente stehen qualifizierten und geschulten Mitgliedern der UNM-Gemeinschaft zur Verfügung. Gemeinsam genutzte Instrumente sind während der regulären Geschäftszeiten und zu anderen Zeiten nach besonderer Vereinbarung verfügbar. Bitte wenden Sie sich an das Personal der ATG-Einrichtung, um weitere Informationen zu Tests und Preisen zu erhalten.
ATG-FAQs
Dies sind Richtlinien für Forscher, die über die Nutzung von Next-Generation Sequencing (NGS)-Diensten der ATG Shared Resource nachdenken. Alle Forscher werden dringend gebeten, sich mit den Mitarbeitern der ATG zu beraten, bevor sie mit der Vorbereitung oder Analyse von Proben beginnen. Wir können Sie bei der Versuchsplanung unterstützen und Sie bei Bedarf mit erfahrenen Biostatistikern in Kontakt bringen, die Ihnen bei der Versuchsplanung helfen können. Es ist sehr wichtig, das experimentelle Design zu berücksichtigen, bevor Sie mit NGS-Experimenten beginnen, die ziemlich teuer sein können.
Bulk-RNA-Seq kann erfolgreich mit minimalen RNA-Mengen durchgeführt werden, so wenig wie 1ng mRNA. ATG überprüft ihre Integrität (RIN) nach Erhalt der RNAs mithilfe des Agilent Bioanalyzers. Empfohlene Eingaben für RNA-Seq sind 150 ng Gesamt-RNA für hochwertige RNAs und 250 ng für degradierte RNAs (z. B. FFPE-RNA). RNAs werden dann ribodepletiert, um unerwünschte rRNA zu entfernen, die etwa 90 % der RNA in Zellen ausmacht.
NGS-Experimente können teuer sein und die Kosten variieren je nach Test. Darüber hinaus hängen die Gesamtkosten vom Kit ab, das zum Erstellen der Bibliotheken verwendet wird, und von der erforderlichen Sequenzierungstiefe. Bitte wenden Sie sich an das Personal, um weitere Informationen und ein Angebot zu erhalten.
NGS-Tests erzeugen umfangreiche, komplexe Datensätze, die enorme Mengen an Informationen enthalten, deren Analyse jedoch auch eine Herausforderung sein kann. Die ATG Shared Resource bietet die erste Analyseebene, einschließlich der Analyse von Qualitätskontrollparametern, der Ausrichtung der Lesevorgänge auf das entsprechende Genom sowie der Identifizierung von Sequenzvarianten oder Merkmalszählungen, je nach Bedarf.
ATG Shared Resource verfügt über ein Team von Bioinformatik-Experten, die die erste Datenanalyse durchführen und die Daten verwalten und sichern. Sie können die meisten einfachen Analysetypen durchführen (z. B. Genexpression aus RNA-Sequenz). Detailliertere Analysen, wie z. B. die Korrelation von Ergebnissen mit Patienteninformationen, sollten mit den Eingaben der Bioinformatics Shared Resource oder der Biostatistics Shared Resource durchgeführt werden. Die ATG-Mitarbeiter können dabei helfen, Interaktionen mit den entsprechenden Experten einzurichten, die von Anfang an einbezogen werden sollten, um bei der Versuchsplanung und Qualitätskontrolle zu helfen. Bitte besprechen Sie Ihre Analyseanforderungen mit den Mitarbeitern.
Die Verifizierung ist ein integraler Bestandteil jedes NGS-Experiments und die Anforderungen variieren je nach Art des Experiments. Bitte wenden Sie sich an das ATG-Personal, um die Möglichkeiten zur Verifizierung von NGS-Ergebnissen zu besprechen.
Der Einrichtungsleiter, Dr. Viswanathan Palanisamy, kann Unterstützungsschreiben und Ratschläge zur Beschreibung der ATG Shared Resource und potenzieller NGS-Experimente in Zuschussanträgen bereitstellen. Dr. Palanisamy war in zahlreichen Studienabteilungen von NIH, ACS und DOD tätig und hat viele Zuschussanträge, darunter auch NGS-Experimente, geprüft. Seine eigenen Zuschüsse beinhalten NGS-Experimente. Er kann Ihnen beim Verfassen von Abschnitten Ihres Zuschusses zu NGS-Experimenten helfen und auf potenzielle Fallstricke und Dinge hinweisen, die Sie vermeiden sollten.
Der einfachste Weg, ein NGS-Experiment zu kritisieren, besteht darin, es als Angelexpedition zu beschreiben. Hier sind einige Dinge, die Sie unbedingt vermeiden sollten.
- Schlagen Sie nicht vor, Gene zu charakterisieren, die Sie noch nicht identifiziert haben. Wenn Sie keine vorläufigen Daten haben, wissen Sie nicht, welche oder wie viele Gene Sie finden werden. Es werden jedoch wahrscheinlich Hunderte sein. Einfach zu sagen, dass Sie einige interessante Gene zum Studieren auswählen werden, ist ein schneller Weg, um eine schlechte Bewertung für Ihr Stipendium zu bekommen. Wenn möglich, sollte Ihr Experiment eine Hypothese testen. Sie könnten beispielsweise die Hypothese aufstellen, dass bestimmte Gene (z. B. Apoptose-Gene) induziert werden. Dann können Sie vorschlagen, NGS-Tests zu verwenden, um dies zu testen (und Echtzeit-PCR als Backup-Ansatz vorschlagen). Auf diese Weise können Sie eine Hypothese testen, erwartete Ergebnisse und Kontrollen vorschlagen (z. B. Gene, die rauf und runter gehen sollten), was eine viel bessere Art ist, ein NGS-Experiment (oder jedes andere Experiment) durchzuführen. Einfach nach Genen zu fischen, ist ein schlechter Ansatz und zieht immer den Zorn des Überprüfungsausschusses auf sich.
- Auch wenn Sie einfach sagen, dass Sie ein Softwareprogramm verwenden werden, um die Daten zu analysieren oder die Gene in Pfade zu gruppieren, werden Sie in Schwierigkeiten geraten. NGS-Daten können äußerst komplex sein und erfordern statistische Analysemethoden. Die bekannten Pfaddaten sind bedauerlicherweise unvollständig. Die meisten Gene befinden sich ohnehin nicht in den Pfaden. Sie benötigen einen gut geplanten Ansatz zur Analyse der Daten. Sie sollten eine Möglichkeit haben, festzustellen, ob das Experiment funktioniert hat oder nicht (z. B. wurden die erwarteten Apoptosegene aktiviert?).
- Das NGS-Experiment sollte nicht nur ein Absatz am Ende eines Ihrer Ziele sein. Was auch immer Sie tun, fügen Sie auf keinen Fall ein NGS-Experiment am Ende eines Zuschussantrags hinzu, als etwas, das Sie "auch tun werden". NGS-Experimente sind groß, teuer und kompliziert und können nicht nachträglich durchgeführt werden. Viele, viele Stipendien enthalten eine einteilige Beschreibung eines NGS-Experiments, das die Forscher auch durchführen werden. Das ist ein Blitzableiter für Kritik von den Rezensenten.
- Wenn Sie nach Genen suchen, sollten Sie sie aus einem bestimmten Grund suchen. Schlagen Sie nicht einfach vor, nach regulierten Genen zu suchen, ohne vorzuschlagen, etwas mit ihnen zu tun. Die Gene zu finden, die nach oben und unten gehen, ist kein bedeutendes Ziel. Sie müssen mit einem bestimmten Zweck nach Genen suchen (z. B. eine zu testende Hypothese).