Analytische und Translationale Genomik

Dies sind Richtlinien für Forscher, die über die Nutzung von Next-Generation Sequencing (NGS)-Diensten der ATG Shared Resource nachdenken. Alle Forscher werden dringend gebeten, sich mit den Mitarbeitern der ATG zu beraten, bevor sie mit der Vorbereitung oder Analyse von Proben beginnen. Wir können Sie bei der Versuchsplanung unterstützen und Sie bei Bedarf mit erfahrenen Biostatistikern in Kontakt bringen, die Ihnen bei der Versuchsplanung helfen können. Es ist sehr wichtig, das experimentelle Design zu berücksichtigen, bevor Sie mit NGS-Experimenten beginnen, die ziemlich teuer sein können.

RNA-seq kann mit sehr kleinen Mengen an RNA erfolgreich durchgeführt werden. Die erforderliche Menge hängt jedoch von der erforderlichen "Lesetiefe" ab und davon, ob eine ribosomale RNA-Kontamination vorliegt. Ribosomale RNA macht 90% der RNA in Zellen aus, daher ist es notwendig, die ribosomale RNA zu entfernen oder zu reduzieren, bevor RNA-seq. Die zwei Möglichkeiten, dies zu tun, sind die physikalische Entfernung durch "Ribodepletion", bei der biotinylierte Sonden, die komplementär zu den ribosomalen RNAs sind, mit den RNA-Proben hybridisiert, dann die Komplexe eingefangen und entfernt werden. Alternativ kann eine Poly-A-gerichtete Bibliotheksvorbereitungsmethode (zB Smart-Seq) verwendet werden, die die Sequenzierung der ribosomalen RNA vermeidet, aber andere RNAs ausschließt, denen PolyA-Schwänze fehlen und die von Interesse sein könnten (zB microRNAs). Bitte kontaktieren Sie die Mitarbeiter von ATG Shared Resource, um Optionen zu besprechen, bevor Sie mit den Experimenten beginnen.

Die ATG Shared Resource führt eine Full-Service-NGS-Analyse durch. Aufgrund der Komplexität der NGS-Bibliotheksvorbereitung hängt die Leistung von ATG jedoch von der Art des Experiments ab. Für die gezielte Panel- und Exom-Sequenzierung benötigen wir nur DNA-Proben und erstellen die Bibliotheken, führen die Sequenzierung und die Erstanalyse durch. Vor Beginn der Arbeiten erstellen wir Ihnen ein Angebot über die voraussichtlichen Kosten. Für RNA-seq und andere Ansätze gibt es viele Variationen in der Art und Weise, wie Bibliotheken konstruiert werden können. Wir empfehlen den Benutzern, sich vor Beginn an die Mitarbeiter von ATG zu wenden, um Optionen zu besprechen. Neben dem kompletten Affymetrix-System verfügt das ATG Shared Resource über ein Nanodrop-Spektrometer zur Quantifizierung von RNA in kleinen Volumina und einen Agilent Bioanalyzer zur schnellen Analyse der Qualität und Quantität von RNA- oder DNA-Proben.

NGS-Experimente können teuer sein. Die Gesamtkosten für die meisten großen Experimente (Exom-Sequenzierung, RNA-Seq usw.) betragen 500 bis 800 US-Dollar pro Probe zuzüglich einer Gebühr für Bioinformatik. Einige kleinere gezielte Sequenzierungsexperimente kosten weniger pro Probe. Bitte kontaktieren Sie die Mitarbeiter für weitere Informationen und um ein Angebot zu erhalten.

Ja! NGS-Experimente erzeugen große, komplexe Datensätze. Ohne Duplikate ist eine bioinformatische Analyse nicht möglich. Triplikate sind besser. Replikate sind wirklich notwendig, um gute Ergebnisse zu erzielen, die aussagekräftig sind und ihren Preis wert sind.

Die ATG Shared Resource befolgt strenge Qualitätskontrollrichtlinien und Standardarbeitsanweisungen, um sicherzustellen, dass die Daten von höchster Qualität sind und die von Gruppen wie dem ENCODE-Konsortium festgelegten Standards erfüllen oder übertreffen. Wir verwenden standardmäßige Spike-in-Kontrollen, um interne Prozesse zu überwachen und Qualitätskontrollen in jeder Phase der Bibliotheksproduktion und Sequenzierung durchzuführen. Bitte wenden Sie sich an die ATG-Mitarbeiter, um Beispiele für die von uns erfolgreich erstellten Daten zu sehen.

Die Qualität der Ausgangs-RNA-Proben wird mit dem Agilent BioAnalyzer oder mit Real-Time-PCR bestätigt. Die Bibliotheken werden vor der Sequenzierung auf ähnliche Weise überprüft. Spike-in-Kontrollen werden in mehreren Schritten hinzugefügt, um die interne Qualitätskontrolle zu überwachen.

NGS-Assays produzieren große, komplexe Datensätze, die enorme Mengen an Informationen enthalten, aber auch schwierig zu analysieren sein können. Die ATG Shared Resource bietet die erste Analyseebene, einschließlich der Analyse von Qualitätskontrollparametern, dem Abgleich der Reads mit dem entsprechenden Genom, der Identifizierung von Sequenzvarianten oder Merkmalszählungen, je nach Bedarf und der Durchführung einfacher Arten der Interpretation, wie der Erstellung von Heatmaps für RNA-seq. Kompliziertere Arten der Datenanalyse, wie die Korrelation von Ergebnissen mit Patienteninformationen, sollten jedoch unter Einbeziehung von Experten der Bioinformatics Shared Resource oder der Biostatistics Shared Resource durchgeführt werden. Die Mitarbeiter der ATG können beim Aufbau von Interaktionen mit den entsprechenden Experten helfen, die von Anfang an in die Versuchsplanung und Qualitätskontrolle einbezogen werden sollten.

Es besteht die Möglichkeit, dass der komplexe Prozess der Generierung von NGS-Daten einen "Tageseffekt" oder "Batch-Effekt" erzeugt, bei dem die Proben zusammen mit denselben Daten verarbeitet oder analysiert werden. Dies ist ein bekanntes Artefakt der hochdimensionalen Datenanalyse, und wir integrieren Spike-In-Steuerelemente, die uns helfen, diese Arten von Datenproblemen zu identifizieren und zu beseitigen.

Die ATG Shared Resource verfügt über ein Team von Bioinformatik-Experten, die die erste Datenanalyse durchführen und die Daten verwalten und sichern. Sie können die einfachsten Arten von Analysen durchführen (zB Genexpression von RNA-seq). Komplexe oder kundenspezifische Analysen erfordern jedoch den Input zusätzlicher Experten aus den Shared Resources Biostatistics oder Bioinformatics. Die ATG-Mitarbeiter können beim Aufbau der erforderlichen Kooperationen helfen.

Die Verifizierung ist ein wichtiger Bestandteil jedes NGS-Experiments und die Anforderungen variieren je nach Art des Experiments. Bitte wenden Sie sich an das ATG-Personal, um Möglichkeiten zur Überprüfung der NGS-Ergebnisse zu besprechen.

Der Einrichtungsleiter, Scott A. Ness, Ph.D., kann Unterstützungsschreiben und Ratschläge zur Beschreibung der ATG Shared Resource und potenzieller NGS-Experimente in Förderanträgen geben. Dr. Ness hat an zahlreichen NIH-, ACS- und DOD-Studienabschnitten mitgewirkt und viele Zuschussanträge geprüft, die NGS-Experimente beinhalten. Seine selbst finanzierten Stipendien enthalten NGS-Experimente. Er kann Ihnen beim Schreiben von Abschnitten Ihres Stipendiums zu NGS-Experimenten helfen und auf mögliche Fallstricke und Dinge hinweisen, die Sie vermeiden sollten.

Der einfachste Weg, ein NGS-Experiment zu kritisieren, besteht darin, es als Angelexpedition zu beschreiben. Hier sind einige Dinge, die Sie unbedingt vermeiden sollten.

1. Schlagen Sie nicht vor, Gene zu charakterisieren, die Sie noch nicht identifiziert haben. Wenn Sie keine vorläufigen Daten haben, wissen Sie nicht, welche Gene oder wie viele Gene Sie finden werden. Sie werden jedoch wahrscheinlich in die Hunderte gehen. Einfach zu sagen, dass Sie einige interessante Gene zum Studieren auswählen werden, ist ein schneller Weg, um eine schlechte Punktzahl für Ihr Stipendium zu erhalten. Wenn möglich, sollte Ihr Experiment eine Hypothese testen. Sie könnten zum Beispiel die Hypothese aufstellen, dass bestimmte Gene (zB Apoptose-Gene) induziert werden. Dann können Sie vorschlagen, NGS-Assays zu verwenden, um dies zu testen (und Echtzeit-PCR als Backup-Ansatz vorschlagen). Auf diese Weise können Sie eine Hypothese testen, erwartete Ergebnisse und Kontrollen vorschlagen (zB Gene, die nach oben und unten gehen sollten), was eine viel bessere Art ist, ein NGS-Experiment (oder jedes andere Experiment) durchzuführen. Einfach nur nach Genen zu fischen, ist ein schlechter Ansatz und zieht immer den Zorn des Prüfungsausschusses auf sich.
2. Einfach zu sagen, dass Sie ein Softwareprogramm verwenden werden, um die Daten zu analysieren oder die Gene in Pfade zu gruppieren, wird Sie ebenfalls in Schwierigkeiten bringen. NGS-Daten können äußerst komplex sein und erfordern statistische Methoden zur Analyse. Die bekannten Pfaddaten sind erbärmlich unvollständig. Die meisten Gene sind sowieso nicht in den Pfaden enthalten. Sie benötigen einen gut geplanten Ansatz für die Analyse der Daten. Sie sollten eine Möglichkeit haben zu erkennen, ob das Experiment funktioniert hat oder nicht (zB wurden die erwarteten Apoptose-Gene aktiviert?).
3. Das NGS-Experiment sollte nicht nur ein Absatz am Ende eines Ihrer Ziele sein. Was auch immer Sie tun, fügen Sie auf keinen Fall ein NGS-Experiment am Ende eines Zuschussantrags hinzu, als etwas, das Sie "auch tun werden". NGS-Experimente sind groß, teuer und kompliziert und können nicht nachträglich durchgeführt werden. Viele, viele Stipendien enthalten eine einteilige Beschreibung eines NGS-Experiments, das die Forscher auch durchführen werden. Das ist ein Blitzableiter für Kritik von den Rezensenten.
4. Wenn Sie nach Genen suchen, sollten Sie sie aus einem bestimmten Grund suchen. Schlagen Sie nicht einfach vor, nach regulierten Genen zu suchen, ohne vorzuschlagen, etwas mit ihnen zu tun. Die Gene zu finden, die nach oben und unten gehen, ist kein bedeutendes Ziel. Sie müssen mit einem bestimmten Zweck nach Genen suchen (z. B. eine zu testende Hypothese).